5 resultados para L. infantum chagasi
em ARCA - Repositório Institucional da FIOCRUZ
Resumo:
A leishmaniose visceral (LV) é uma doença grave que afeta a população de vários paÃses, onde o Brasil apresenta a maior prevalência da infecção nas Américas. Com o estudo do gene codificante da proteÃna B de superfÃcie (HASPB ou K26) de Leishmania infantum é possÃvel identificar as variações polimórficas intraespecÃficas e, assim, será possÃvel consolidar a descrição de um perfil polimórfico presente no Estado de Pernambuco. O objetivo do trabalho foi analisar as regiões polimórficas do gene HASPB (K26) de Leishmania infantum em amostras clÃnicas positivas para leishmaniose visceral e coinfecção LV/HIV. O sistema K26 PCR foi otimizado utilizando concentrações variadas de DNA genômico de L. infantum. Foi realizado o screening de amostras clÃnicas de DNA através de dois sistemas de PCR simples, kDNA e ITS1/RFLP, para ensaios posteriores com a K26 PCR nas amostras positivas. A curva de dissociação de alta definição (qPCR-HRM) foi empregada na localização de temperaturas de melting especÃficas para L. infantum. Os amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados as sequencias selecionadas em base de dados. A K26 PCR apresentou limiar de detecção de 1 pg para amplicon de 700 pb. A especificidade dos primers foi avaliada experimentalmente e in silico, apresentando anelamento inespecÃfico com DNA humano. Em paralelo, foram selecionadas 78 amostras de DNA através dos dois sistemas screening, sendo 17 caracterizadas como L. infantum. Os ensaios com DNA das amostras clÃnicas para o sistema K26 PCR revelaram bandas espúrias. A análise através qPCR-HRM em DNA genômico do parasita resultou em amplificação com Tm de 88,2 °C, já o ensaio com amostra clÃnica revelou duas amplificações com distintas temperaturas de melting, 84,6 e 88,2 °C. Três amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados a cinco sequencias da base de dados, indicando 38,2 % de similaridade. Pode-se concluir que o sistema K26 PCR é recomendável para análise dos polimorfismos genéticos, contanto que o DNA seja extraÃdo diretamente de espécies isoladas em meio de cultura.
Resumo:
Os tripanossomatÃdeos possuem uma combinação não usual de mecanismos moleculares, e seus processos de regulação de expressão gênica ocorreram a nÃvel pós-transcricional. Acredita-se que essa regulação envolva tanto o controle da estabilidade dos mRNAs, como sua tradução em proteÃnas, eventos em que atua a proteÃna de ligação à cauda poli-A (PABP - Poly-A Binding Protein), uma das principais proteÃnas de ligação a RNAs em eucariotos. Um grande número destas proteÃnas está presente nos tripanosomatÃdeos, se caracterizando por possuÃrem domÃnios tÃpicos de ligação a RNA, como o domÃnio RRM (RNA Recognition Motif). Dentre estas se destacam as proteÃnas de ligação a sequências ricas em uridina (UBPs), que se mostraram capazes de interagir com homólogos de PABP. Outras proteÃnas hipotéticas contendo domÃnios de ligação a RNA foram identificadas em ensaios que buscavam parceiros diferenciais para os três homólogos de PABP de Leishmania. Este trabalho se propôs a contribuir na caracterização funcional das proteÃnas UBPs e das proteÃnas hipotéticas, através da otimização de sua expressão de forma heteróloga em L. infantum, fusionadas ao epÃtopo HA. Para isto, os genes codificantes dos três homólogos de UBPs, e de cinco outras proteÃnas de ligação a RNA que parecem interagir com PABPs, foram amplificados e clonados em vetor de expressão de Leishmania. As construções geradas foram transfectadas em L. infantum e a expressão de seis destas proteÃnas avaliada. Os resultados obtidos mostram uma variação no reconhecimento das proteÃnas geradas com anticorpos comerciais anti-HA, que parecem depender da sequência de aminoácidos da sua extremidade C-terminal. Diferenças significativas nos seus nÃveis de expressão também foram observadas. Entre os três homólogos de UBP, dois destes se mostraram mais abundantes enquanto que os três são representados por mais de uma banda, indicando possÃveis modificações pós-traducionais
Resumo:
A gp63, metalopeptidase altamente abundante na superfÃcie de Leishmania, contribui para uma infinidade de funções bem estabelecidas na interação deste parasito com o hospedeiro mamÃfero. No entanto, apesar desta molécula ser abundantemente expressa na superfÃcie das formas promastigotas, encontradas no inseto vetor, pouco é conhecido sobre as funções desempenhadas por essa metalopeptidase no flebotomÃneo. Nosso grupo de pesquisa, utilizando abordagens bioquÃmicas, tem demonstrado que moléculas de gp63 de vários tripanosomatÃdeos não patogênicos ao homem estão implicadas na adesão ao intestino de insetos hospedeiros. Aqui, nós analisamos o papel da gp63 na interação de Leishmania braziliensis e Leishmania infantum, com os seus respectivos insetos hospedeiros, Lutzomyia intermedia e Lu. longipalpis e com a linhagem celular derivada de Lu. longipalpis (LL5). Os intestinos dissecados de insetos foram prétratados ou não com o fosfoglicano (PG) puro derivado do lipofosfoglicano e colocados para interagir com os parasitos. Em paralelo, promastigotas de L. braziliensis e L. infantum foram pré-tratados com anticorpo anti-gp63 ou com inibidores da metalopeptidase. Depois disso, os parasitos foram colocados para interagir com os intestinos dissecados de insetos ou com as células LL5 Como esperado, o PG praticamente elimina a capacidade dos parasitos de se ligarem ao intestino dos insetos. Todos os tratamentos relacionados com a gp63 também provocaram uma diminuição acentuada nestes ensaios de ligação. Além disso, o sobrenadante de cultura de L. braziliensis foi concentrado por precipitação com sulfato de amônio e analisado por SDS-PAGE e SDS-PAGE-gelatina. Observamos uma degradação proteolÃtica, por volta de 63 kDa, que corresponde à enzima gp63 já identificada e caracterizada em várias espécies de Leishmania. Esses resultados em conjunto demonstram uma possÃvel participação da gp63 na interação com o inseto vetor e nos estimulam a continuar estudando o papel dessa metalopeptidase no ciclo de vida de Leishmania
Resumo:
Os tripanossomatÃdeos são organismos caracterizados pelo controle póstranscricional da expressão gênica, principalmente em nÃvel de tradução. Na tradução em eucariotos, tem grande destaque o complexo eIF4F, sendo um de seus principais componentes o fator de iniciação da tradução eIF4E. Já foram descritos em tripanossomatÃdeos seis homólogos para o eIF4E, nomeados EIF4E1 a 6. Em um estudo com Leishmania amazonensis, focado no EIF4E3, percebeu-se que seu perfil de expressão se alterava rapidamente numa curva de crescimento, com este apresentando ao menos duas bandas. As mudanças observadas sugeriam modificações pós-traducionais do tipo fosforilação, algo posteriormente confirmado. Analisando-se a sequência do EIF4E3 de Leishmania, foi possÃvel identificar a presença de possÃveis sÃtios de fosforilação e de ligação a parceiros funcionais como homólogos do eIF4G, outro componente do complexo eIF4F, e da proteÃna de ligação á cauda poli-A (PABP). No presente estudo foi analisado o perfil de expressão e a capacidade de ligação a parceiros funcionais do EIF4E3 de Leishmania superexpresso em células transfectadas e no qual foram introduzidas mutações em motivos especÃficos. Os resultados mostraram um perfil de expressão de ao menos três bandas para o EIF4E3 de L. amazonensis e duas para L. infantum, com o sÃtio S75, presente apenas na primeira, sendo o responsável por esta diferença. Em ensaios de imunoprecipitação, foi identificado um motivo que, quando mutado, aboliu a ligação do EIF4E3 com a PABP3, sugerindo este como o sÃtio de interação entre os fatores. Com a análise do efeito de mutações no EIF4E3 de L. amazonensis, foi percebido que ao se mutar três motivos implicados na à PABP e o possÃvel sÃtio de ligação ao EIF4G, sua fosforilação diminuiu drasticamente, sugerindo a necessidade destas interações para que a fosforilação ocorra. Estes resultados indicam um complexo mecanismo de modificações pós-traducionais responsáveis pela regulação do EIF4E3 e contribuem a para a caracterização da sua função em Leishmania
Resumo:
A leishmaniose visceral (LV) é uma doença infecto-parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania. O trabalho teve como objetivo avaliar estratégias para o aprimoramento do diagnóstico molecular na LV, que compreenderam a avaliação da eficiência de diferentes métodos de extração de DNA em amostras de urina; a análise do uso da Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) como ferramenta para a detecção do DNA de Leishmania infantum na referida amostra; e a padronização de uma reação duplex qPCR para a detecção simultânea do DNA de L. infantum e do gene G3PD (controle endógeno). Depois da escolha do protocolo de extração de DNA mais apropriado, e após a otimização e a análise de reprodutibilidade, uma qPCR em urina foi padronizada. Em paralelo, após o desenho e a sÃntese de sondas TaqMan® compatÃveis com os sistemas LINF 1B e G3PD1, após otimização e análise de reprodutibilidade, uma duplex qPCR em sangue também foi padronizada. Para avaliação dos protocolos desenvolvidos foram utilizadas técnicas de estatÃstica descritiva. Para análise comparativa com técnicas clássicas de diagnóstico da LV utilizou-se Teste Qui Quadrado de independência ou Teste Exato de Fisher (p<0,05 e p<0,01, respectivamente). Como resultados, após otimização, o limite de detecção alcançado pela qPCR em urina utilizando o protocolo de extração selecionado (kit comercial) foi de 5 fg/microlitros de amostra 0,034 parasitos) A duplex qPCR em sangue alcançou um limite de detecção de 2x102 fg/microlitros de amostra 1,4 (ou ~ 1,4 parasito), após a otimização. A partir dos dados estatÃsticos obtidos, pôde-se analisar alta concordância percentual entre a qPCR e urina e o conjunto de critérios diagnósticos (sorologia rK39 + qPCR em sangue), bem como entre a duplex qPCR em sangue e a qPCR em sangue, para os Grupos 01 (pacientes com suspeita de LV) e 02 (pacientes HIV positivos co-infectados ou não). Como um conjunto de critérios, os dois novos ensaios obtiveram excelentes concordâncias com o conjunto de técnicas clássicas: 88,89 por cento e 94,74 por cento para os Grupos 01 e 02, respectivamente. Não houve diferenças estatÃsticas significativas entre os testes. Pôde-se concluir que ambos os ensaios mostraram bom potencial para a incorporação, após validação, ao diagnóstico da LV; em conjunto ou individualmente (quando necessário), trazendo mais conforto, praticidade, confiabilidade e rapidez ao diagnóstico definitivo da patologia